Molekularna genetyczna heterogenność niedoboru miofosforylaz (choroba McArdlea) ad

Krew uzyskano od 5 pacjentów z chorobą McArdle a, 12 osób zdrowych i 8 pacjentów z różnymi miopatiami metabolicznymi: 2 z padaczką miokloniczną i strzępiastymi włóknami mięśniowymi; 2 z mitochondrialną encefalomiopatią, kwasicą mleczanową i epizodami podobnymi do udaru; z niedoborem fosfundruktazy; z niedoborem kinazy fosfoglicerynianowej; z niedoborem mutacji fosfoglicerynianu; i z niedoborem kinazy fosforylazowej. Ekstrakcja i amplifikacja RNA
Figura 1. Figura 1. Amplifikacja PCR fragmentów cDNA myofosforylazy (górny panel) i genomowego DNA (dolny panel). Zacienione ramki wskazują nieprzetłumaczone regiony; bp oznacza pary zasad. Sekwencje nukleotydowe starterów od do 16 zostały zdeponowane w National Auxiliary Publications Service. (Patrz dokument nr 05036 NAPS dla jednej strony materiału pomocniczego, zamówienie od NAPS c / o Microfiche Publications, PO Box 3513, Grand Central Station, Nowy Jork, NY 10163-3513.).
Całkowity RNA wyekstrahowano od 30 do 70 mg mięśnia od czterech pacjentów z chorobą McArdle a ze zmodyfikowaną metodą wirowania chlorkiem cezu12. Sześć fragmentów DNA obejmujących cały region kodujący komplementarny DNA miofosforylazy (cDNA) bezpośrednio amplifikuje się z każdej próbki RNA (około 500 ng) z primerami i 3, 2 i 5, 4 i 7, 6 i 9, 8 i 11, i 10 i 12 (Figura 1), z zestawem do reakcji łańcuchowej polimerazy RNA z odwrotną transkryptazą (PCR) rTth rTth rTth (Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, Connecticut), zgodnie ze specyfikacjami producenta.
Ekstrakcja i amplifikacja genomowego DNA
Genomowy DNA ekstrahowano z mięśni lub komórek białych jak opisano wcześniej13. Odpowiednie fragmenty do analizy enzymem restrykcyjnym amplifikowano za pomocą polimerazy Taq i odczynników otrzymanych z Boehringer-Mannheim (Indianapolis), zgodnie z instrukcjami producenta, oraz starterów pokazanych na Figurze 1. Dla primerów do 13 i 16, 17, 18, i 19, PCR wykonywano przez 30 cykli składających się z denaturacji w 94 ° C przez jedną minutę, hybrydyzacji w 60 ° C przez jedną minutę i wydłużania w 72 ° C przez dwie minuty. W przypadku krótkiego fragmentu między starterami 14 i 15 przeprowadzono PCR w 2 cyklach składających się z denaturacji w 94 ° C przez jedną minutę, hybrydyzacji w 60 ° C przez jedną minutę i wydłużania w 72 ° C przez jedną minutę, a następnie 38 cykli składających się z denaturacji w temperaturze 91 ° C przez jedną minutę, hybrydyzacji w 65 ° C przez jedną minutę i wydłużania w 72 ° C przez jedną minutę.
Sekwencjonowanie
Amplifikowane fragmenty DNA sekwencjonowano bezpośrednio tymi samymi starterami stosowanymi do amplifikacji i zestawem do sekwencjonowania BRL (GIBCO BRL Life Technologies, Gaithersburg, MD), zgodnie ze specyfikacjami producenta. Fragmenty DNA poddano sekwencyjnemu programowi PCR w obecności 2 pmoli primera, którego koniec 5 znakowano [32P] ATP. Produkty PCR poddano elektroforezie na żelu składającym się z 6% poliakryloamidu i 7 M mocznika. Żel suszono pod próżnią przez godzinę i wystawiono na działanie filmu Kodak XAR (Eastman Kodak, Rochester, Nowy Jork) przez 12 godzin. Sekwencję całego regionu kodującego u czterech pacjentów porównano z wcześniej opisaną sekwencją genu myofosforylazowego9
[więcej w: nfz kielce przeglądarka skierowań, pou u lekarza, zdjęcie rtg zębów ]