Molekularna genetyczna heterogenność niedoboru miofosforylaz (choroba McArdlea) cd

Różnice potwierdzono przez porównanie z kontrolnym sekwencjonowaniem DNA w tym samym czasie. Testy restrykcyjno-enzymatyczne
Zastosowano endonukleazy restrykcyjne NlaIII (New England Biolabs, Beverly, Mass.), HaeIII (Boehringer-Mannheim) i MaeIII (Boehringer-Mannheim) z buforami dostarczonymi przez producentów i zgodnie z ich specyfikacjami. Trawienie restrykcyjne analizowano za pomocą elektroforezy na żelu agarozowym 2% NuSieve (FMC Bioproducts, Rockland, Me.) Lub 12% żelu poliakrylamidowym.
Wyniki
Tabela 1. Tabela 1. Miejsca i skutki mutacji w genie myofosforylazy. Rycina 2. Rycina 2. Badania w rodzinie z pozorną autosomalną dominującą transmisją choroby McArdle a. Panel A pokazuje rodowód. Kwadraty oznaczają męskich członków rodziny i kręcą kobiece członki rodziny. Liczby w symbolach są numerami odpowiednich kodonów. W panelu B, panelu C i panelu D analiza polimorfizmów długości fragmentów restrykcyjnych u członków rodziny ujawniła odpowiednio mutacje 1, 2 i 3. W panelach B i panelu D zastosowano żele agarozowe, aw panelu C żel akryloamidowy (szczegóły w sekcji Metody). Rozmiary fragmentów (pary zasad) są pokazane po prawej stronie.
Wyciągnęliśmy RNA z próbek pobranych z biopsji mięśni od czterech pacjentów z chorobą McArdle a i amplifikowaliśmy cały cDNA genu myofosforylazy. Sześć częściowo zachodzących na siebie fragmentów DNA otrzymanych w ten sposób zsekwencjonowano bezpośrednio (Figura 1). Porównanie z opublikowaną sekwencją ludzkiego genu myofosforylazowego10 i sekwencjami fragmentów DNA z mięśnia kontrolnego uzyskanych w tym samym czasie ujawniło mutacje trzypunktowe. Aby wykluczyć artefakty, zsekwencjonowaliśmy obydwie nici DNA w zmutowanych regionach. Dwaj pacjenci byli homozygotyczni pod względem mutacji z jedną bazą, podstawienie tyminy na cytozynę (C do T) w kodonie 49 w obrębie pierwszego egzonu genu myofosforylazy, zmiana kodowanej argininy (CGA) na kodon stop (TGA) (mutacja w Tabeli 1). Inny pacjent był heterozygotyczny pod względem dwóch różnych mutacji (heterozygota złożona), substytucji adeniny dla guaniny (G do A) w kodonie 204 w eksonie 5, zmiany kodowanej glicyny (GGC) na serynę (AGC) (mutacja 2 w Tabeli 1) i podstawienie cytozyny dla adeniny (A do C) w kodonie 542 w eksonie 14, zmiana kodowanej lizyny (AAG) na treoninę (ACG) (mutacja 3 w Tabeli 1). Czwarty pacjent, matka w rodzinie, w której choroba była najwyraźniej przenoszona w sposób autosomalny dominujący (ryc. 2), miał mutację 2 i okazał się również heterozygotą złożoną (patrz poniżej).
Rycina 3. Rycina 3. Wykorzystanie analizy restrykcyjno-enzymatycznej do wykrywania mutacji 1, 2 i 3 u pacjentów z chorobą McArdle a. Sekwencje nukleotydowe otaczające miejsca restrykcyjne są pokazane po lewej stronie, ze strzałkami wskazującymi zmiany zasad. Fragmenty DNA po amplifikacji PCR są pokazane po prawej stronie, ze strzałkami wskazującymi miejsca restrykcyjne dla diagnostyki. Liczby powyżej lub poniżej fragmentów DNA wskazują długości odcinków w parach podstawowych. Należy zwrócić uwagę, że mutacje i 3 powodują przyrost miejsc restrykcyjnych odpowiednio dla NlaIII i MaeII, podczas gdy mutacja 2 powoduje utratę miejsca dla HaeIII
[podobne: markery nowotworowe cennik, nfzkielce, przegladarka skierowan nfz ]