Molekularna genetyczna heterogenność niedoboru miofosforylaz (choroba McArdlea) czesc 4

Startery stosowane do amplifikacji PCR pokazano na Figurze 1. Aby potwierdzić te trzypunktowe mutacje i przesiać dużą liczbę pacjentów, zaprojektowano startery do amplifikacji PCR genomowego DNA. Fragmenty DNA zamplifikowane przez startery i 13, 14 i 15 oraz 16 i 9 zawierały odpowiednio mutacje 1, 2 i 3 (Figura 1), a trawienie enzymami restrykcyjnymi NlaIII, HaeIII i MaeII odróżniało normalną sekwencję od każdego z nich. trzech zmutowanych sekwencji (rysunek 3). Wyniki analizy endonukleazy restrykcyjnej potwierdzono przez sekwencjonowanie fragmentów PCR.
Tabela 2. Tabela 2. Mutacje punktowe w genie myofosforylazowym u 40 pacjentów z chorobą McArdle a. Wyniki amplifikacji PCR genomowego DNA, a następnie analizy enzymów restrykcyjnych u 40 pacjentów z chorobą McArdle a przedstawiono w Tabeli 2. Osiemnaście pacjentów było homozygotycznych pod względem mutacji 1, w tym u dziecka z śmiertelną miopatią dziecięcą; trzy były heterozygotami złożonymi dla mutacji i 2; osiem było złożonymi heterozygotami dla mutacji i drugą, jak dotąd niezidentyfikowaną, mutacją; jeden pacjent miał mutacje i 3; dwa miały mutacje 2 i 3; a trzy miały mutację 2 i niezidentyfikowany zmutowany allel. U pięciu pacjentów nie znaleźliśmy żadnej z trzech mutacji punktowych.
Jeden z czterech pacjentów z mutacją 2 w cDNA mięśni okazał się heterozygotą złożoną, ponieważ analiza restrykcyjna wykazała mutacje i 2. Ta pacjentka była dotkniętą matką w rodzinie z rzekomo autosomalnym dominującym dziedziczeniem (Figura 2). Bezobjawowy ojciec był heterozygotyczny pod względem mutacji 3, a wszystkie trzy dzieci były heterozygotami złożonymi (ryc. 2).
Dyskusja
Geny dla trzech izoenzymów ludzkiej fosforylazy, charakterystyczne dla dojrzałego mięśnia szkieletowego, wątroby i mózgu, zostały sklonowane, zsekwencjonowane i zlokalizowane na chromosomach 11, 14 i 10 lub 209,14,15. W przeciwieństwie do genu dla izoenzymu wątroby, który jest wysoce polimorficzny, 14 gen specyficzny dla mięśnia nie zawiera znanych neutralnych polimorfizmów długości fragmentów restrykcyjnych (RFLP), i tylko poprzez rozszerzenie analizy do regionów flankujących możliwe było wykrycie dwóch RFLP, wystarczające do zidentyfikowania 75 procent osób zagrożonych; w tej analizie Lebo i in. nie wykryli delecji u pacjentów z chorobą McArdle a16. W tym badaniu nie stwierdziliśmy delecji u czterech pacjentów, u których sekwencjonowano cały cDNA miofosforylazy. Zamiast tego istniały trzy wyraźne mutacje punktowe w eksonach 1, 5 i 14.
Najpowszechniejszą mutacją była mutacja C-to-T w kodonie 49 w eksonie 1, zmieniająca kodowaną argininę na kodon stop. Ta mutacja była obecna w obu allelach u 18 pacjentów i u jednego allelu w 12, co stanowiło 75 procent wszystkich pacjentów. Pozostałe dwie mutacje były rzadsze i występowały tylko w stanie heterozygotycznym; mutacja G-to-A w kodonie 204 w eksonie 5 występowała u ośmiu pacjentów, a mutacja A-to-C w kodonie 542 w eksonie 14 stwierdzono u trzech pacjentów. W nienaruszonym białku każda z tych mutacji missense miałaby mieć szkodliwe konsekwencje funkcjonalne. Mutacja w kodonie 204 znajduje się w domenie zaangażowanej w wiązanie glikogenu i tetrameryzację, a mutacja w kodonie 542 wpływa na domenę wiążącą glukozę9,17.
Występowanie wielu mutacji wyjaśnia stosunkowo dużą liczbę pacjentów, którzy mieli różne mutacje w dwóch allelach: 6 pacjentów zostało udowodnionych, a 11 zostało uznanych za heterozygoty złożone
[hasła pokrewne: pou u laryngologa, usg barku kraków, diagnoza genetyczna ]